タンパク質工学（タンパクしつこうがく）は、有用または価値のあるタンパク質を開発するプロセスであり、多くの場合、自然界に存在するアミノ酸配列を変更することによって、人工的なポリペプチドを設計・製造する"Protein engineering - Latest research and news | Nature". www.nature.com. Retrieved 2023-01-24.。タンパク質のフォールディングの理解や、タンパク質の設計原理の認識などに多くの研究が行われている新しい学問分野である。 工業用触媒（生体触媒）として多くの酵素の機能向上に利用されている。また、製品・サービス市場において、2017年には1680億米ドルの市場場規模になると推定されている"Speeding Up the Protein Assembly Line". Genetic Engineering and Biotechnology News. 13 February 2015.。
タンパク質工学には、合理的なタンパク質設計と指向性進化という2つの一般的な戦略がある。これらの方法は互いに排他的なものではなく、研究者はしばしばその両方をもちいることになる。将来的には、タンパク質の構造と機能に関するより詳細な知識と、ハイスループットスクリーニングの進歩により、タンパク質工学の能力は大きく向上する可能性がある。最終的には、拡張遺伝暗号のような、遺伝暗号に新規アミノ酸をコード化する新しい手法によって、非天然アミノ酸も含めることができるようになるかもしれない。
アプローチ
合理的設計
合理的設計では、科学者がタンパク質の構造と機能に関する詳細な知識を用いて、所望の変更を加えることができる。一般に、部位特異的変異導入法が発達しているため、安価で技術的に容易であるという利点がある。しかし、タンパク質の詳細な構造情報が得られないことが多く、また、得られたとしても、構造情報はタンパク質の構造を静的に示すことが多いため、様々な変異の効果を予測することが非常に難しいという大きな欠点がある。しかし、Folding@homeやFolditのようなプログラムは、タンパク質の折り畳みモチーフを知るためにクラウドソーシング技術を利用しているFarmer, Tylar Seiya; Bohse, Patrick; Kerr, Dianne (2017). "Rational Design Protein Engineering Through Crowdsourcing". Journal of Student Research. 6 (2): 31–38. doi:10.47611/jsr.v6i2.377. S2CID 57679002。
計算タンパク質設計アルゴリズムは、あらかじめ指定された標的構造に折り畳まれたときに低エネルギーである新規アミノ酸配列を同定することを目的としている。探索すべき配列-構造空間は広いが、計算タンパク質設計の最も困難な要件は、最適な配列と類似の最適でない配列を区別できる、高速かつ正確なエネルギー関数である。
多重配列アライメント タンパク質の構造情報がない場合、配列解析はタンパク質に関する情報を解明するのに役立つことが多い。これらの手法では、対象となるタンパク質の配列を、他の関連するタンパク質の配列とアライメントする。このアラインメントにより、どのアミノ酸が生物種間で保存され、タンパク質の機能にとって重要であるかを示すことができる。これらの分析により、変異の標的部位となりうるホットスポットアミノ酸を特定することができる。多重配列アライメントは、PREFAB、SABMARK、OXBENCH、IRMBASE、BALIBASEなどのデータベースを利用して、ターゲットタンパク質の配列を既知の配列と相互参照するものである。多重配列アライメントの手法を以下に示す。
この方法は、まずk-tuple法またはNeedleman-Wunsch法を用いて配列のペアワイズアライメントを行う。これらの方法は、配列ペア間のペアワイズ類似性を表すマトリックスを計算する。類似度スコアは距離スコアに変換され、近隣結合法を用いてガイドツリーを作成するために使用される。このガイドツリーを用いて、多重配列アライメントが行われる。
Clustal omega この方法は、k-tuple法を利用することで、最大19万個の配列のアライメントが可能である。次に、mBed法とk-means法を用いて配列のクラスタリングを行う。そして、HH alignパッケージで使用されているUPGMA法を用いてガイドツリーを構築する。このガイドツリーを用いて、多重配列アラインメントを作成する。
MAFFT この方法は、高速フーリエ変換（FFT）を利用して、アミノ酸配列を各アミノ酸残基の体積と極性の値からなる配列に変換する。この新しい配列を用いて、相同領域を探索する。
K-Align この方法は、Wu-Manber近似文字列マッチングアルゴリズムを利用し、多重配列アライメントを生成する。
Multiple sequence comparison by log expectation (MUSCLE) KmerとKimura距離を利用して、多重配列アラインメントを生成する方法である。
T-Coffee 本手法は、アライメントの進化にツリーベースの整合性目的関数を利用する。本手法は、Clustal Wと比較して5-10%の精度があることが示されている。
共進化解析 共進化解析は、相関変異、共分散、共置換とも呼ばれる。このタイプの合理的設計は、進化的に相互作用する遺伝子座における相互進化的変化を伴う。一般に、この方法は、ターゲット配列のキュレーションされた多重配列アラインメントを作成することから始まる。このアラインメントは、高度にギャップがある配列や、配列同一性の低い配列を削除する手動改良が行われる。このステップにより、アライメントの品質が向上する。次に、手動で処理されたアライメントは、異なる相関変異アルゴリズムを用いた更なる共進化解析に利用される。これらのアルゴリズムにより、共進化スコアリング・マトリックスが生成される。このマトリックスは、重要な共進化の値を抽出し、バックグラウンドノイズを取り除くために、様々な有意性テストを適用してフィルタリングされる。共進化解析はさらに評価され、その性能と厳密性が評価される。最後に、この共進化解析の結果を実験的に検証する。
構造予測 タンパク質のde novoタンパク質構造予測には、既存のタンパク質構造に関する知識が必要である。既存のタンパク質構造に関する知識は、新しいタンパク質構造を予測するのに役立つ。タンパク質構造予測の方法は、第一原理法、フラグメントベース法、ホモロジーモデリング法、タンパク質スレッディング法の4つのクラスに分類される。
Ab initio これらの方法は、テンプレートに関する構造情報を一切使用せずに、自由なモデリングを行うものである。第一原理計算法は、タンパク質の自由エネルギーの大域的最小値に対応するネイティブな構造を予測することを目的としている。第一原理計算法の例としては、AMBER、GROMOS、GROMACS、CHARMM、OPLS、ENCEPP12がある。第一原理計算の一般的な手順は、 対象となるタンパク質を幾何学的に表現することから始まる。次に、 タンパク質のポテンシャルエネルギー関数モデルを作成する。このモデルは、分子力学ポテンシャルまたはタンパク質構造由来のポテンシャル関数のいずれかを使用して作成することができる。ポテンシャルモデルの開発に続いて、分子動力学シミュレーション、モンテカルロシミュレーション、遺伝的アルゴリズムなどのエネルギー探索技術がタンパク質に適用される。
フラグメントベース法 これらの方法は、構造に関するデータベース情報を利用して、作成されたタンパク質配列に相同な構造をマッチングさせるものである。これらの相同構造をスコアリングと最適化によりコンパクトな構造に組み上げ、ポテンシャルエネルギーが最も低くなることを目標とする。フラグメント情報のウェブサーバとしては、I-TASSER、ROSETTA、ROSETTA@home、FRAGFOLD、CABS fold、PROFESY、CREF、QUARK、UNDERTAKER、HMM、ANGLOR:72がある。
ホモロジー モデリング これらの方法は、タンパク質の相同性に基づくものである。これらの方法は、比較モデリングとしても知られている。ホモロジーモデリングの最初のステップは、一般に、問い合わせ配列と相同な構造を持つテンプレート配列の同定である。次に、問い合わせ配列をテンプレート配列にアライメントする。アラインメントに続いて、構造的に保存された領域がテンプレート構造を用いてモデル化される。続いて、テンプレートとは異なる側鎖やループをモデリングする。最後に、モデル化された構造は、洗練され、品質が評価される。ホモロジーモデリングデータが利用可能なサーバーは以下である。SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA, I-TASSER.
タンパク質スレッディング タンパク質スレッディングは、問い合わせ配列の信頼できるホモログが見つからない場合に使用でる。この方法は、まず、問い合わせ配列とテンプレート構造のライブラリを入手することから始まる。次に、問い合わせ配列を既知のテンプレート構造上にスレッド化する。これらの候補モデルは、スコアリング関数を用いてスコアリングされる。これらの候補は、問い合わせ配列とテンプレート配列の潜在的なエネルギーモデルに基づいてスコアリングされる。そして、最も低いポテンシャルエネルギーモデルを持つマッチが選択される。スレッディングデータを取得し、計算を行うための方法とサーバーをここに列挙する。GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP server, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED3D, LIBRA, TOPITS, RAPTOR, COTH, MUSTER.
合理的設計の詳細については、部位特異的変異導入を参照。
多価結合 多価結合は、アビディティ効果によって結合特異性と親和性を高めるために使用することができる。1つの生体分子や複合体に複数の結合ドメインがあると、個々の結合事象を介して他の相互作用が起こる可能性が高くなる。アビディティや有効親和力は、個々の親和力の合計よりもはるかに高くすることができ、標的結合のためのコストと時間効率のよいツールとなるLiu, Cassie J.; Cochran, Jennifer R. (2014), Cai, Weibo (ed.), "Engineering Multivalent and Multispecific Protein Therapeutics", Engineering in Translational Medicine, London: Springer, pp. 365–396, doi:10.1007/978-1-4471-4372-7_14, ISBN 978-1-4471-4372-7, retrieved 2021-12-08。
多価タンパク質 多価タンパク質は、翻訳後修飾やタンパク質をコードするDNA配列の多重化によって、比較的容易につくることができる。多価および多特異性タンパク質の主な利点は、既知のタンパク質の標的に対する有効な親和性を高めることができることである。不均一な標的の場合、タンパク質の組み合わせによって多特異的な結合をもたらすことで特異性を高めることができ、タンパク質治療薬として高い応用性を持つ。
多価結合の最も一般的な例は抗体であり、二重特異性抗体の研究が盛んに行われている。二重特異性抗体の応用は、診断、イメージング、予防、治療など幅広い分野に及んでいる。
指向性進化 指向性進化では、ランダムな変異導入（例えば、エラープローンPCRや配列飽和変異導入など）がタンパク質に適用され、選択システムが望ましい形質を持つ変異体を選択するために使用される。その後、さらに変異と選択を繰り返す。この方法は自然進化を模倣したもので、一般に合理的な設計よりも優れた結果をもたらす。さらに、DNAシャッフリングと呼ばれるプロセスでは、成功した変異体の断片を混ぜ合わせ、より良い結果を得ることができるようにする。このようなプロセスは、有性生殖の際に自然に起こる組換えを模倣している。指向性進化の利点は、タンパク質の構造に関する事前の知識を必要とせず、ある変異がどのような効果をもたらすかを予測できる必要がないことである。実際、指向性進化実験の結果は、望ましい変化が、ある効果を持つとは予想されていなかった変異によって引き起こされることが多く、驚くべきものである。欠点は、ハイスループットスクリーニングが必要なことで、すべてのタンパク質について実現可能なわけではない。大量の組換えDNAを変異させ、その産物を所望の形質についてスクリーニングする必要がある。変異体の数が多いため、プロセスを自動化するために高価なロボット装置が必要になることも多い。さらに、すべての所望の活性を簡単にスクリーニングできるわけではない。
自然界のダーウィン進化は、触媒作用を含む様々な用途のためにタンパク質の特性を調整するために、研究室内で効果的に模倣することができる。大規模で多様なタンパク質ライブラリーを作成し、フォールディングされた機能的な変異体をスクリーニングまたは選択するために、多くの実験技術が存在する。フォールディングされたタンパク質は、ランダムな配列空間において驚くほど頻繁に出現し、この現象を利用して選択的な結合剤や触媒を進化させることができる。深い配列空間から直接選択するよりも保守的ではあるが、ランダムな変異誘発と選択・スクリーニングによって既存のタンパク質を再設計することは、既存の特性を最適化したり変更したりするための特に強固な方法である。また、より野心的な工学的目標を達成するための優れた出発点でもある。実験的進化と最新の計算機的手法の組み合わせは、自然界に存在しない機能的な高分子を生み出すための、最も広範で実りある戦略であると思われる。
高品質な変異ライブラリーを設計するための主な課題は、近年大きな進展を見せている。この進歩は、タンパク質の形質に対する変異負荷の影響について、よりよく説明できるようになったという形で表れている。また、計算機によるアプローチでは、数え切れないほど大きな配列空間を、より管理しやすいスクリーニング可能なサイズにすることで、スマートな変異体ライブラリーを作成することに大きな進歩があった。また、系統的な組換えアルゴリズムを用いて、有益な残基を特定することにより、ライブラリーのサイズはよりスクリーニング可能なサイズに縮小された。最後に、タンパク質の機能に対する変異の影響を定量化し予測する、より正確な統計モデルとアルゴリズムの開発により、酵素の効率的なリエンジニアリングに向けて大きな前進を遂げた。
一般に、指向性進化は、タンパク質の変異体ライブラリーを作成し、ハイスループットスクリーニングを行い、形質が改善された変異体を選択する、2段階の反復プロセスとして要約されることがある。この手法では、タンパク質の構造と機能の関係についての予備知識は必要ない。指向性進化は、ランダムまたはフォーカスされた変異導入を利用して、変異タンパク質のライブラリーを作成するものである。ランダム変異は、エラープローンPCRや部位飽和変異導入法を用いて導入することができる。また、複数の相同遺伝子の組換えによって変異体を生成することもある。自然界では、限られた数の有益な配列が進化してきた。指向性進化は、新しい機能を持つ未発見のタンパク質配列を同定することを可能にする。この能力は、タンパク質がフォールディングや安定性を損なうことなくアミノ酸残基の置換に耐えられるかどうかにかかっている。
指向性進化法は、無性進化法と有性進化法の2つの戦略に大別される。
無性進化法 無性進化法では親遺伝子間のクロスリンクは発生しない。単一遺伝子を用いて、様々な変異導入技術を用いて変異体ライブラリーを作成する。これらの無性進化法では、ランダムな変異導入と標的をしぼった変異導入のいずれかに分類ができる。
ランダム変異導入法 ランダム変異導入法では、対象となる遺伝子全体にランダムに変異を生じさせる。ランダム変異導入法では、次のようなタイプの変異を導入することができる：トランジション、トランスバージョン、挿入、欠失、インバージョン、ミスセンス、およびナンセンス。ランダム変異を作り出す方法の例を以下に示す。
エラープローンPCR エラープローン PCRは、Taq DNAポリメラーゼが3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性を持たないことを利用したものである。その結果、1回の複製でヌクレオチドあたり0.001-0.002%のエラーが生じる。この方法は、まず変異させたい遺伝子、あるいは遺伝子内の領域を選択することから始まる。次に、作りたい活性の種類や程度に応じて、必要なエラーの程度を算出する。このエラーの大きさによって、エラープローンPCR法が決定される。PCRの後、遺伝子はプラスミドにクローニングされ、コンピテントセルシステムに導入される。これらの細胞は、所望の形質についてスクリーニングされる。プラスミドは、改良された形質を示すコロニーから単離され、次の突然変異導入のテンプレートとして使用される。エラープローンPCRでは、特定の変異に対して他の変異と比較してバイアスがかかる。例えば、トランスバージョンよりもトランジションに偏りがある
PCRのエラーは、次のような方法で増大する可能性がある。
非相補的な塩基対を安定化させる塩化マグネシウムの濃度を上げる。 ２塩基対特異性を低下させる塩化マンガンを添加する。 dNTPの添加量を増やし、不均衡にする。 dITP、8オキソ-dGTP、dPTPのような塩基アナログの添加。 Taqポリメラーゼの濃度を上げる。 伸長時間を長くする。 サイクルタイムを長くする。 より精度の低いTaqポリメラーゼを使用する。
詳しくはポリメラーゼ連鎖反応を参照。
ローリングサークルエラープローンPCR このPCR法は、細菌が環状のDNAを増幅する方法を模したローリングサークル増幅法に基づいている。この方法では、線状のDNA二重鎖が得られる。この断片はコンカタマーと呼ばれる環状DNAのタンデムリピートを含んでおり、細菌株に形質転換することができる。変異は、まず標的配列を適切なプラスミドにクローニングすることで導入される。次に、ランダムヘキサマープライマーとΦ29DNAポリメラーゼを用い、エラープローンローリングサークル増幅の条件で増幅を開始する。エラープローンローリングサークル増幅を行うための追加条件は、1.5pMのテンプレートDNA、1.5mMのMnCl2、24時間の反応時間である。MnCl2は、DNA鎖のランダムな点突然変異を促進するために反応混合物に添加される。変異率は、MnCl2の濃度を上げるか、テンプレートDNAの濃度を下げることで高めることができる。ローリングサークル増幅は、特異的なプライマーではなく、普遍的なランダムヘキサマープライマーを使用するため、エラーが起こりやすいPCRと比較して有利である。また、この増幅の反応生成物は、リガーゼやエンドヌクレアーゼで処理する必要がない。この反応は等温反応である。
化学的変異導入 化学的変異導入は、化学試薬を使用して遺伝子配列に変異を導入することである。化学的変異原の例を以下に示す。
二硫酸ナトリウムは、G/Cに富んだゲノム配列の変異に効果的である。これは、二硫酸ナトリウムがメチル化されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化を触媒するためである。
メタンスルホン酸エチルはグアニジン残基をアルキル化する。この変化により、DNAの複製時にエラーが発生する。
亜硝酸はアデニンとシトシンの脱アミノ化により転化を起こす.
ランダム化学変異導入の二重アプローチは、反復的な2段階のプロセスである。まず、EMS（メタンスルホン酸エチル）によって目的の遺伝子をin vivoで化学的に変異させる。次に、処理した遺伝子を単離し、プラスミドバックボーンの変異を防ぐために、未処理の発現ベクターにクローニングする。この手法で、プラスミドの遺伝的性質が保たれる。
Targeting glycosylases to embedded arrays for mutagenesis (TaGTEAM) この方法は、酵母の標的型in vivo突然変異導入に利用されている。この方法では、tetR DNA結合ドメインに3-メチルアデニンDNAグリコシラーゼを融合させる。これにより、tetO部位を含むゲノムの領域で、変異率が800倍以上増加することが示されている。
ランダム挿入・欠失による変異導入法 この方法では、任意の長さの塩基の塊を同時に削除・挿入することで、配列の長さを変化させることができる。この方法では、新しい制限部位、特定のコドン、非天然アミノ酸の4塩基コドンの導入により、新しい機能性を持つタンパク質を作り出すことができることが示されている。
トランスポゾンを用いたランダム変異導入法 近年、トランスポゾンを利用したランダム変異導入法が数多く報告されている。この方法には、以下のようなものがあるが、これらに限定されるものではない。PERMUTE-ランダム環状順列、ランダムタンパク質切断、ランダム塩基トリプレット置換、ランダムドメイン/タグ/複数アミノ酸挿入、コドン走査突然変異導入、マルチコドン走査突然変異導入。これらの技術は、すべてmini-Muトランスポゾンの設計を必要とする。サーモ・サイエンティフィック社では、これらのトランスポゾンを設計するためのキットを製造している。
標的DNAの長さを変えるランダム変異導入法 この方法では、挿入変異や欠失変異によって遺伝子の長さを変化させることができる。例えば、タンデムリピート挿入（TRINS）法である。これは、ローリングサークル増幅法によって標的遺伝子のランダムな断片のタンデムリピートを生成し、このリピートを標的遺伝子に同時に組み込むという手法である。
ミューテーター株 ミューテーター株とは、1つまたは複数のDNA修復機構が欠損している細菌細胞株のことである。ミューテーター株の例として、大腸菌XL1-REDがある.この大腸菌の下位株は、MutS、MutD、MutT DNA修復経路が欠損している。ミューテーター株は、様々な変異を導入するのに有効であるが、株自身のゲノムに変異が蓄積されるため、培養不良が進行する。
標的をしぼった変異導入法 標的をしぼった突然変異導入法では、あらかじめ決められたアミノ酸残基に変異を生じさせる。これらの手法では、対象となるタンパク質の配列と機能との関係を理解する必要がある。この関係を理解することで、安定性、立体選択性、触媒効率に重要な残基を同定することができる。以下に、標的をしぼった変異導入法の例を示す。
部位飽和型変異 部位飽和変異導入は、タンパク質の機能において重要な役割を持つアミノ酸を標的とするために用いられるPCRベースの方法である。これを実行するための2つの最も一般的な技術は、全プラスミドシングルPCRとオーバーラップエクステンションPCRである。
全プラスミドシングルPCRは部位特異的変異導入site directed mutagenesis (SDM)とも呼ばれる。SDM産物はDpnエンドヌクレアーゼ切断に供される。親鎖はアデニンのN6でメチル化されたGmATCを含んでいるため、この切断により親鎖のみが切断される。SDMは10キロベースを超えるような大きなプラスミドにはうまく機能しない。また、この方法は一度に2つのヌクレオチドを置換することしかできない.
オーバーラップエクステンション PCRでは、2組のプライマーを使用する必要がある。各セットの1つのプライマーは変異を含んでいる。これらのプライマーセットを用いた1回目のPCRが行われ、2本の二本鎖DNAが形成される。次に2回目のPCRを行い、これらの二重鎖を変性させ、再びプライマーセットとアニールさせ、各鎖に変異を持つヘテロ二重鎖を生成する。新たに形成されたヘテロ二重鎖の隙間はDNAポリメラーゼで埋められ、さらに増幅される。
配列飽和変異導入法 Sequence saturation mutagenesis (SeSaM) 配列飽和変異導入法では、標的配列がすべてのヌクレオチド位置でランダム化される。この方法は、まず、3'末端に鋳型転写酵素を使用することにより、普遍的な塩基を持つ可変長のDNA断片を生成することから始まる。次に、これらの断片を一本鎖の鋳型を用いて全長まで伸ばす。万能塩基はランダムな標準塩基に置換され、変異を導入する。この方法には、SeSAM-Tv-II、SeSAM-Tv+、SeSAM-IIIなど、いくつかの改良版が存在する。
Single primer reactions in parallel (SPRINP) この部位飽和変異導入法では、2回に分けてPCR反応を行う。そのうちの1回目はフォワードプライマーのみを使用し、2回目の反応ではリバースプライマーのみを使用する。これにより、プライマーダイマー形成が回避される。
Mega primed and ligase free focused mutagenesis この部位飽和変異導入技術は、1つの変異導入オリゴヌクレオチドと1つのユニバーサルフランキングプライマーから始まる。これら2つの反応物は最初のPCRサイクルに使用される。この最初のPCRサイクルからの生成物は、次のPCRのためのメガプライマーとして使用される。
Ω-PCR オーバーラップエクステンションPCRに基づく部位飽和変異導入法である。環状プラスミド中の任意の部位に変異を導入するために使用される。
PFunkel-ominchange-OSCARR この方法は、ユーザー定義の部位特異的変異導入を、単一または複数の部位で同時に利用するものである。OSCARRは、カセットのランダム化と組換えのための1ポット・シンプルな方法one pot simple methodology for cassette randomization and recombinationの頭文字をとったものである。このランダム化と組換えにより、タンパク質の所望の断片をランダム化することができる。Omnichangeは、遺伝子上の独立したコドンを5つまで飽和させることができる、配列に依存しないマルチサイト飽和変異導入法である。
Trimer-dimer mutagenesis この方法では、冗長なコドンや停止コドンを取り除く.
カセット変異導入法