mały|alt=Cienkie, białawe nici DNA wytrącone w przezroczystym roztworze|Oczyszczone nici DNA podobne do frakcji używanej w doświadczeniu transformacji bakterii Eksperyment Avery’ego, MacLeoda i McCarty’ego – doświadczenie mikrobiologiczne opublikowane w 1944 roku przez Oswalda Avery’ego, i Maclyna McCarty’ego, które wykazało, że czynnikiem wywołującym transformację bakterii jest DNA, a nie białko. Praca była zwieńczeniem badań prowadzonych od końca lat 20. XX wieku w Rockefeller Institute for Medical Research nad tzw. czynnikiem transformującym pneumokoki. Wynik przyczynił się do uznania DNA za nośnik informacji genetycznej.

Doświadczenie nawiązywało do odkrytego w 1928 roku przez Fredericka Griffitha zjawiska transformacji pneumokoków (dwoinki zapalenia płuc). Mimo przekonujących kontroli enzymatycznych jego wynik początkowo przyjmowano ze sceptycyzmem, m.in. z powodu utrwalonego przekonania o białkowej naturze genów. Rolę DNA jako nośnika informacji genetycznej dodatkowo potwierdził w 1952 roku eksperyment Hersheya-Chase.

Tło thumb|alt=Czarno-białe portretowe zdjęcie łysiejącego mężczyzny w okrągłych okularach|Oswald Avery (zdjęcie z 1937), kierujący zespołem, który wykazał transformującą rolę DNA Przed odkryciem Avery’ego, MacLeoda i McCarty’ego wielu biologów uważało, że informacja dziedziczna jest przenoszona raczej przez białka niż przez kwasy nukleinowe. Samo słowo „proteina” (synonim białka, z ) było historycznie związane z przekonaniem o jego pierwszorzędnej roli w organizmie (pochodzi od = pierwszej jakości), a DNA postrzegano często jako składnik strukturalny chromosomów o małej swoistości biologicznej. Kontekst medyczny badań stanowiły pneumokoki, które rozróżniano metodami serologicznymi na typy o odmiennej otoczce polisacharydowej.

Frederick Griffith w 1928 roku wykazał w swoim doświadczeniu, że połączenie zabitych cieplnie zjadliwych pneumokoków z żywymi niezjadliwymi komórkami może doprowadzić u myszy do zakażenia typem zjadliwym. Potwierdzenia uzyskali później i w berlińskim oraz w nowojorskim Rockefeller Institute. Dawson i Richard H.P. Sia opracowali następnie metodę transformacji in vitro, bez używania myszy jako gospodarzy. W latach 30. James Alloway, i inni badacze stopniowo przechodzili od obserwacji zjawiska do oczyszczania rozpuszczalnych ekstraktów zawierających czynnik transformujący.

Przebieg doświadczenia mały|alt=Schemat czterech doświadczeń na myszach z pneumokokami typu S i R, ilustrujący zjawisko transformacji|Schemat doświadczenia Griffitha, które stanowiło punkt wyjścia dla późniejszego oczyszczania czynnika transformującego Avery i współpracownicy badali pneumokoki typu III-S, których zjadliwość wiązała się z polisacharydową otoczką. Bakterie zabijano ciepłem, ekstrahowano składniki rozpuszczalne w roztworze soli, chloroformem usuwano białka, a polisacharydy rozkładano enzymatycznie i kontrolowano immunologicznie. Aktywną frakcję DNA wytrącano alkoholem. W efekcie otrzymywano włókniste pasma, które można było wydobyć z roztworu bagietką.

mały|alt=Mikrofotografia skaningowa kilku kulistych bakterii, część ułożona w pary|Mikrofotografia skaningowa dwoinek zapalenia płuc (Streptococcus pneumoniae) – bakterii badanych w doświadczeniu, układających się charakterystycznie w pary Jako układ modelowy zespół badał przemianę bezotoczkowego, szorstkiego szczepu R36A, wywodzącego się z typu II, w otoczkowy pneumokok typu III. Oczyszczoną frakcję wyizolowaną z zabitych ciepłem komórek typu III dodawano do hodowli szczepu R36A. Pod jej wpływem komórki nabywały otoczkę polisacharydową typu III, a nowa cecha była swoista dla typu III i dziedziczna, przekazywana w kolejnych pokoleniach. Do wywołania transformacji wystarczały ilości rzędu 0,003–0,02 µg materiału, co świadczyło o jego wyjątkowej aktywności.

Analiza chemiczna wskazała, że proporcje węgla, wodoru, azotu i fosforu w aktywnej frakcji odpowiadają proporcjom w DNA. Kluczowy był zestaw kontroli enzymatycznych: trypsyna i chymotrypsyna, rozkładające białka, oraz rybonukleaza, rozkładająca RNA, nie niszczyły aktywności transformującej. Znosił ją natomiast preparat enzymatyczny określany wówczas jako deoksyrybonukleodepolimeraza, czyli enzym rozkładający DNA. Wyniki tych kontroli wskazywały, że substancją odpowiedzialną za transformację jest frakcja kwasu deoksyrybonukleinowego.

Charakter aktywnej frakcji potwierdziły również metody fizyczne. W ultrawirówce preparat dawał pojedynczą, ostrą granicę sedymentacji, a w elektroforezie – pojedynczy składnik o dużej ruchliwości typowej dla kwasu nukleinowego. Widmo absorpcji w ultrafiolecie miało maksimum w okolicy 260 nm, typowe dla kwasów nukleinowych. Masa cząsteczkowa preparatu była rzędu 500 000.

Późniejsze badania miały zweryfikować zastrzeżenia dotyczące możliwego zanieczyszczenia białkiem. oczyścił i wykrystalizował deoksyrybonukleazę I. wykazał z kolei, że cały wykrywany azot aminokwasowy – śladowy sygnał traktowany jako wskaźnik domieszki białka – pochodził w istocie z glicyny powstającej przy rozpadzie adeniny. Był to zatem artefakt wynikający z rozpadu samego DNA, a nie ślad białka. Możliwe zanieczyszczenie białkiem Hotchkiss oszacował na najwyżej 0,02%. W 1952 roku Hotchkiss przedstawił dodatkowe dane w książce Phosphorus Metabolism.

Recepcja Odbiór pracy nie był jednoznaczny. Phoebusa Levene’a przedstawiała DNA jako regularny polimer o niewielkiej swoistości, a krystalizacja wirusa mozaiki tytoniu przez Wendella Stanleya w 1935 roku wzmacniała wyobrażenie, że geny, enzymy i wirusy mogą być przede wszystkim białkami. opisała później ten kontekst jako splot teorii wirusów, genów i enzymów w pierwszej połowie XX wieku. Źródłem wątpliwości był też status samych bakterii, co do których część uczonych nie miała pewności, czy w ogóle podlegają prawom genetyki. Na przykład Cyril Hinshelwood tłumaczył ich właściwości, w tym adaptację i mutacje, zmianami równowag biochemicznych, a nie działaniem genów.

Avery uważał wynik za bardzo ważny, ale zarazem ostrożnie formułował jego konsekwencje. Jeszcze przed publikacją opisał dotychczasowe badania nad czynnikiem transformującym i ich możliwe konsekwencje dla genetyki w długim liście do brata Roya, bakteriologa z Uniwersytetu Vanderbilta, napisanym między 13 a 26 maja 1943 roku. Zaznaczał w nim, że wynik nie został jeszcze ostatecznie dowiedziony, i stwierdzał między innymi, że „przyjemnie jest puszczać bańki mydlane, ale mądrzej przekłuć je samemu, zanim zrobi to ktoś inny”. Fragmenty korespondencji opublikowano dopiero w latach 60., a niemal pełny tekst zamieścił w biografii Avery’ego z 1976 roku. List bywa przywoływany jako świadectwo, że zespół zdawał sobie sprawę z genetycznych implikacji swoich wyników. Znaczenie odkrycia dostrzegli też niektórzy ówcześni naukowcy. Jeszcze w 1943 roku australijski wirusolog Frank Macfarlane Burnet po rozmowie z Averym napisał do żony, że ten dokonał odkrycia będącego „niczym innym jak wyizolowaniem czystego genu w postaci kwasu deoksyrybonukleinowego”.

Ocena znaczenia pracy z 1944 roku nie jest w historiografii jednomyślna. porównywał ją do odkryć Mendla jako rezultat niedoceniony w momencie publikacji, natomiast Joshua Lederberg i wskazywali ją jako początek genetyki molekularnej. Według publikacja szybko wzbudziła zainteresowanie części mikrobiologów, biochemików i genetyków. Erwin Chargaff i Hermann Joseph Muller chwalili ją jako dowód biologicznej swoistości DNA. Jednocześnie jednym z głównych krytyków pozostawał biochemik , który kwestionował wnioski dotyczące DNA, wskazując na możliwą domieszkę białka w badanych preparatach. W 1945 roku Royal Society przyznało Avery’emu Medal Copleya m.in. za prace nad transformacją bakteryjną.

Praca Avery’ego była cytowana co najmniej 239 razy w latach 1944–1954, szczególnie w mikrobiologii, immunochemii i biochemii, a do 2026 r. – ponad 3350 razy. twierdził, że rozszerzył wyniki transformacji na Escherichia coli, choć inni badacze nie potwierdzili tego wyniku. Wynikami Avery’ego zainteresowała się też skupiona wokół Maxa Delbrücka tzw. , badająca bakteriofagi. Część jej członków próbowała powtórzyć doświadczenie, a dla innych oznaczało ono, że hipotezę o DNA jako głównym składniku fagów należy traktować poważniej. W 1946 roku Joshua Lederberg i Edward Tatum odkryli jednak rekombinację genetyczną u E. coli, co przyczyniło się do uznania bakterii za pełnoprawny obiekt badań genetycznych.

Mimo licznych cytowań i przychylnych głosów Avery nie otrzymał Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny, do której był nominowany niemal co roku w latach 1932–1944, głównie za badania immunochemiczne. Fundacja Nobla po latach publicznie wyraziła żal, że jej nie otrzymał.

Znaczenie dla genetyki molekularnej

W latach 50. wyniki Avery’ego stały się częścią szerszej zmiany poglądów na naturę genu. Erwin Chargaff pokazał, że skład zasad DNA różni się między gatunkami, a zarazem jest stały w różnych tkankach tego samego organizmu, co czyniło go charakterystycznym dla gatunku i podważało prostą hipotezę tetranukleotydową. Dwa lata później eksperyment Hersheya-Chase wykazał, że podczas infekcji bakteriofagiem do komórki bakteryjnej wnika przede wszystkim DNA, a nie białko. W tym okresie coraz częściej opisywano dziedziczność bakterii i organizmów wyższych tym samym językiem molekularnym. Maurice Wilkins wspominał, że doświadczenie Avery’ego odegrało istotną rolę w skłonieniu jego oraz , kierownika wydziału fizyki w King’s College London, do kontynuowania rentgenowskich badań struktury DNA. Wiosną 1951 roku Wilkins zaszczepił zainteresowanie tymi badaniami u Jamesa Watsona.

Joshua Lederberg w rocznicowym eseju z 1994 roku opisywał pracę Avery’ego, MacLeoda i McCarty’ego jako przełom, który zmienił genetykę przez powiązanie jej bezpośrednio z DNA. Maclyn McCarty wrócił do historii odkrycia w książce , relacjonując drogę do ustalenia, że geny są zbudowane z DNA. Historycy i filozofowie nauki analizowali eksperyment także jako przykład zmieniających się standardów dowodzenia w chemicznej charakterystyce genu. Do syntetycznych omówień kanonu eksperymentów biologii molekularnej zalicza się też podręcznik Michaela Frya.

+ Eksperyment na tle drogi do molekularnego modelu genu Rok Wydarzenie 1928 Griffith – odkrycie transformacji pneumokoków 1944 Avery, MacLeod i McCarty – DNA jako czynnik transformujący 1950 Chargaff – reguły składu zasad DNA 1952 Hershey–Chase – DNA nośnikiem informacji w bakteriofagu 1953 Watson i Crick – model podwójnej helisy DNA

Zobacz też

Przypisy

Linki zewnętrzne

Kategoria:Biologia molekularna Kategoria:Eksperymenty naukowe Kategoria:Genetyka Kategoria:Historia biologii