Nel 1912 è stato il primo professore di lingua inglese presso l'Università Carolina di Praga. Nel 1926 fonda il Circolo linguistico di Praga, meglio noto come Scuola di Praga, e ne rimane il presidente fino al 1945, anno della sua morte. Dopo la sua morte gli è stato dedicato il Vilém Mathesius Centre for Research and Education in Semiotics and Linguistics nell'università.
Opere principali Dějiny literatury anglické I–II (Storia della letteratura inglese I–II) Čeština a obecný jazykozpyt (Lingua ceca e linguistica generale) Obsahový rozbor současné angličtiny (Analisi dei contenuti della lingua inglese) výbor Jazyk, kultura a slovesnost (Antologia del linguaggio, cultura ed arte poetica) Nebojte se angličtiny
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